Pourcentage de pureté HPLC : 7 raisons puissantes pour lesquelles deux rapports peuvent afficher des résultats différents
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Que signifie réellement le pourcentage de pureté HPLC ?
Le pourcentage de pureté HPLC est l’une des données les plus souvent mal interprétées sur un certificat d’analyse (COA) de peptide.
Un chercheur peut recevoir un rapport indiquant 99,6 % de pureté HPLC, tandis qu’un autre rapport concernant ce qui semble être le même lot indique 98,4 %.
La réaction immédiate est souvent :
« L’un des laboratoires doit forcément se tromper. »
Ce n’est pas nécessairement le cas.
Un pourcentage de pureté HPLC est le résultat d’une méthode analytique et d’un processus de traitement des données. Il ne s’agit pas simplement d’un chiffre indépendant du laboratoire, de l’instrument, des conditions chromatographiques, de la préparation de l’échantillon et des critères de calcul.
Cette distinction est particulièrement importante lorsqu’on compare des COA de peptides provenant de différents laboratoires.
Deux laboratoires peuvent analyser un matériau provenant du même lot de production et obtenir des pourcentages de pureté HPLC différents, sans que l’un des deux laboratoires ait nécessairement produit un résultat trompeur.
La vraie question n’est donc pas :
« Quel laboratoire a obtenu le pourcentage le plus élevé ? »
La meilleure question est :
« Comment ce pourcentage de pureté HPLC a-t-il été obtenu ? »
C’est précisément ce que nous allons examiner dans cet article.
Après des années d’expérience dans le domaine des peptides et dans l’accompagnement de chercheurs, l’une des leçons les plus importantes que j’ai retenues est qu’un COA doit être interprété comme un document analytique complet, et non comme un simple chiffre mis en évidence dans un tableau.
Depuis 2003, mon travail dans la fourniture de peptides et l’éducation des chercheurs m’a amené à examiner des rapports de laboratoires tiers, à analyser des COA, à échanger avec des laboratoires et à aider des chercheurs à comprendre ce que les résultats analytiques permettent réellement de conclure.
Cette expérience a constamment confirmé un principe :
La méthodologie qui se trouve derrière un pourcentage de pureté HPLC peut être aussi importante que le pourcentage lui-même.
Pourquoi deux rapports HPLC peuvent-ils afficher des pourcentages de pureté différents ?
Plusieurs raisons légitimes peuvent expliquer pourquoi deux laboratoires obtiennent des pourcentages de pureté HPLC différents.
Les principales sont notamment :
- Des colonnes HPLC différentes
- Des phases mobiles différentes
- Des programmes de gradient différents
- Des débits et températures différents
- Des longueurs d’onde de détection différentes
- Des méthodes de préparation d’échantillon différentes
- Des paramètres d’intégration différents
- Des seuils de déclaration différents
- Une manière différente de traiter les pics non identifiés
- Une modification réelle de l’échantillon entre deux analyses
L’écart peut être relativement faible.
Par exemple, un laboratoire peut rapporter :
99,4 %
alors qu’un autre indique :
98,1 %
Cela ne signifie pas automatiquement que le peptide s’est dégradé de 1,3 %.
De la même manière, un résultat de 99,6 % n’est pas automatiquement plus fiable qu’un résultat de 98,7 %.
Il faut d’abord examiner la méthode analytique.
1. Des colonnes HPLC différentes peuvent modifier le résultat
L’un des paramètres les plus importants en HPLC en phase inverse est la colonne chromatographique.
L’analyse des peptides utilise fréquemment des colonnes en phase inverse, notamment des colonnes de type C18. Cependant, deux colonnes toutes deux décrites comme « C18 » ne sont pas nécessairement identiques sur le plan analytique.
Elles peuvent différer au niveau de :
- la taille des particules ;
- la taille des pores ;
- les dimensions de la colonne ;
- la chimie de surface ;
- la charge carbonée ;
- le traitement de surface ;
- la sélectivité ;
- le fabricant ;
- l’âge de la colonne ;
- la température de fonctionnement.
Ces différences peuvent influencer la manière dont les molécules peptidiques proches les unes des autres sont séparées.
Imaginons un échantillon contenant le peptide recherché ainsi que plusieurs espèces apparentées.
Il peut notamment s’agir de :
- séquences tronquées ;
- formes oxydées ;
- formes désamidées ;
- isomères ;
- impuretés issues du procédé de synthèse ;
- produits de dégradation.
Si une colonne offre une excellente séparation entre le peptide principal et une impureté qui élue à proximité, le chromatogramme peut présenter deux pics distincts.
Une autre colonne peut offrir une séparation moins efficace.
Le deuxième composé peut alors apparaître sous la forme d’un épaulement ou d’un pic partiellement superposé au pic principal.
Cela peut influencer l’intégration des pics et, par conséquent, le pourcentage de pureté HPLC rapporté.
C’est pourquoi la simple mention « C18 » sur deux COA ne suffit pas.
Il est préférable de comparer les informations complètes relatives à la colonne.
2. La phase mobile et le gradient jouent un rôle important
La phase mobile constitue un autre élément essentiel de l’analyse HPLC.
Les méthodes HPLC utilisées pour les peptides peuvent employer différentes combinaisons de solvants aqueux et organiques, notamment de l’eau et un modificateur organique tel que l’acétonitrile ou le méthanol, associés à des additifs adaptés à la méthode analytique.
Le profil de gradient détermine la manière dont la composition de la phase mobile évolue pendant l’analyse.
Un gradient peu pentu et un gradient plus rapide ne produisent pas nécessairement la même qualité de séparation.
Prenons deux laboratoires analysant le même peptide.
Laboratoire A
Il utilise un gradient relativement classique qui permet au peptide d’éluer rapidement.
Laboratoire B
Il utilise un gradient plus progressif afin d’améliorer la séparation des composants qui élueront à proximité les uns des autres.
Le laboratoire B peut alors résoudre plusieurs petits pics qui sont difficiles à distinguer sur le chromatogramme du laboratoire A.
Il peut donc rapporter un pourcentage de pureté HPLC inférieur.
Cela ne signifie pas nécessairement que le laboratoire B a analysé un matériau de qualité inférieure.
Il est possible que sa méthode ait simplement permis de mieux séparer des composants que la méthode du laboratoire A ne distinguait pas aussi clairement.
C’est l’une des raisons pour lesquelles la transparence de la méthode est essentielle lorsqu’on compare des COA.
3. La longueur d’onde de détection peut influencer le pourcentage de pureté HPLC
La longueur d’onde utilisée pour la détection UV est également importante.
Les peptides présentent des caractéristiques d’absorbance liées notamment à leurs liaisons peptidiques, et une détection autour de 214 nm est couramment utilisée pour leur analyse.
Cependant, la longueur d’onde appropriée dépend de la méthode analytique et des substances que l’on cherche à caractériser.
Les différentes molécules n’ont pas nécessairement la même réponse UV aux différentes longueurs d’onde.
Modifier la longueur d’onde peut donc modifier la réponse relative apparente de certains pics chromatographiques.
Il faut toutefois éviter une règle trop simpliste telle que :
« 214 nm est toujours correct et 280 nm est toujours mauvais. »
Ce n’est pas une manière scientifiquement rigoureuse d’évaluer une méthode analytique.
La meilleure question est plutôt :
« Quelle longueur d’onde a été utilisée, pourquoi a-t-elle été choisie et est-elle adaptée au peptide et aux impuretés recherchées ? »
Dans l’analyse des peptides, le chromatogramme doit être interprété dans le contexte de l’ensemble de la méthode.
4. Les paramètres d’intégration peuvent modifier la pureté rapportée
C’est l’une des explications les plus souvent négligées lorsque deux rapports HPLC présentent des pourcentages différents.
L’instrument HPLC détecte un signal.
Le chiffre final correspondant à la pureté est obtenu après traitement des données chromatographiques.
Ce traitement implique l’identification des pics et la détermination de leur surface.
Les logiciels d’analyse chromatographique peuvent utiliser différents paramètres d’intégration.
Il peut notamment s’agir de :
- seuils de détection des pics ;
- surface minimale des pics ;
- critères de rapport signal/bruit ;
- positionnement de la ligne de base ;
- séparation des pics ;
- regroupement des pics ;
- fenêtres d’intégration ;
- traitement des épaulements ;
- traitement des pics qui se chevauchent.
Imaginez un chromatogramme présentant un grand pic principal et plusieurs très petits pics.
Une méthode de traitement peut considérer uniquement les pics dépassant un certain seuil comme des impuretés à déclarer.
Une autre peut intégrer des pics de plus faible intensité.
La surface totale attribuée aux impuretés peut alors changer.
Comme la pureté chromatographique est généralement exprimée comme une proportion relative des surfaces intégrées dans le cadre du calcul défini par la méthode, le pourcentage de pureté HPLC rapporté peut lui aussi changer.
Le positionnement de la ligne de base est particulièrement important
Supposons qu’un petit pic chevauche partiellement la traîne du pic principal.
Où le pic principal se termine-t-il ?
À quel endroit l’impureté commence-t-elle ?
Des méthodes d’intégration appropriées peuvent attribuer des surfaces différentes aux deux composants.
C’est pourquoi le chromatogramme lui-même est important.
Un COA indiquant uniquement :
Pureté : 99,8 %
ne fournit pas le même niveau d’information qu’un rapport présentant :
- le chromatogramme complet ;
- les temps de rétention ;
- les surfaces des pics ;
- les pourcentages de surface relative ;
- les informations d’intégration ;
- les détails de la méthode ;
- l’identification de l’échantillon ;
- les informations relatives à l’instrument.
Le chiffre compte.
Les éléments qui permettent de comprendre ce chiffre comptent encore davantage.
5. La préparation de l’échantillon peut produire des résultats différents
Le laboratoire n’analyse pas une notion abstraite appelée « le peptide ».
Il analyse un échantillon préparé dans des conditions précises.
La préparation de l’échantillon peut donc influencer le résultat.
Parmi les variables pertinentes figurent :
- la concentration de l’échantillon ;
- le solvant ;
- la dilution ;
- le mélange ;
- la filtration ;
- les conditions de remise en solution ;
- le délai entre la préparation et l’injection ;
- la température ;
- l’exposition à la lumière ;
- l’exposition à l’oxygène ;
- les conditions de stockage avant l’analyse.
Les peptides peuvent être sensibles à leur environnement, selon leur séquence et leur structure chimique.
Certaines séquences peuvent être davantage susceptibles de subir des phénomènes tels que l’oxydation, la désamidation, l’agrégation ou d’autres formes de dégradation.
Par exemple, un échantillon analysé immédiatement après sa préparation peut ne pas présenter exactement le même profil chromatographique qu’un matériau ayant subi de mauvaises conditions de stockage ou de manipulation avant son analyse.
Cette question devient particulièrement importante lorsque deux laboratoires analysent les échantillons à des moments différents.
Si l’échantillon lui-même a changé, la différence n’est alors plus uniquement liée à la méthode analytique.
Elle peut correspondre à une différence chimique réelle entre les échantillons au moment de leur analyse.
6. Des critères de déclaration différents peuvent produire des résultats différents
Deux laboratoires peuvent observer des profils chromatographiques comparables tout en appliquant des conventions différentes pour la déclaration des résultats.
Par exemple, un laboratoire peut déclarer un ensemble plus large de pics mineurs.
Un autre peut appliquer un seuil de déclaration défini et exclure certains composants situés sous ce seuil du calcul des impuretés déclarées.
Cette différence peut devenir importante lorsqu’un échantillon contient de nombreux composants présents à l’état de traces.
Le chercheur doit donc se poser la question suivante :
« Que signifie exactement le terme “pureté” utilisé par ce laboratoire ? »
S’agit-il :
- du pourcentage de surface du pic principal ?
- de la somme de certains composants chromatographiques ?
- d’une normalisation des surfaces ?
- d’un calcul de pureté validé ?
- d’un autre indicateur défini par le laboratoire ?
Ces notions ne doivent pas automatiquement être considérées comme équivalentes.
C’est particulièrement important lorsqu’on compare des rapports provenant de laboratoires différents.
7. Le peptide peut réellement avoir changé
Toutes les différences ne sont pas nécessairement dues à la méthodologie du laboratoire.
Parfois, le matériau a réellement changé.
Un peptide peut potentiellement subir des modifications pendant :
- le stockage ;
- le transport ;
- des variations de température ;
- des cycles répétés de congélation-décongélation ;
- l’exposition à l’humidité ;
- l’exposition à l’oxygène ;
- une manipulation inadéquate ;
- une conservation prolongée après remise en solution.
C’est pourquoi il est important de comparer :
identité de l’échantillon + numéro de lot + date d’analyse + historique de stockage + méthode analytique.
Si le même lot a été analysé à six mois d’intervalle dans des conditions sensiblement différentes, les deux résultats ne peuvent pas automatiquement être considérés comme représentant exactement le même état analytique du matériau.
Pourcentage de pureté HPLC et teneur réelle en peptide
C’est probablement la distinction la plus importante de tout cet article.
Le pourcentage de pureté HPLC n’est pas identique à la quantité de peptide présente.
Supposons qu’un flacon contienne un matériau présenté comme contenant environ 10 mg.
Le rapport HPLC peut indiquer :
99 % de pureté chromatographique.
Cela fournit une information sur le profil chromatographique du matériau analysé.
Cela ne démontre pas, à lui seul, que le flacon contient exactement 10 mg du peptide cible.
Pourquoi ?
Parce qu’une préparation peptidique lyophilisée peut contenir des composants autres que le peptide cible lui-même.
Selon le procédé de production et la caractérisation du matériau, il peut notamment s’agir de :
- l’humidité résiduelle ;
- contre-ions ou composants salins ;
- solvants résiduels ;
- autres composants ne donnant pas nécessairement une réponse UV équivalente ;
- matières issues du procédé.
Un pourcentage de surface chromatographique ne doit donc pas automatiquement être assimilé à un pourcentage massique.
Exemple simple
Imaginez deux matériaux :
Échantillon A
- Masse totale récupérée : 10 mg
- Pureté HPLC par normalisation des surfaces : 99 %
Échantillon B
- Masse totale récupérée : 7 mg
- Pureté HPLC par normalisation des surfaces : 99 %
Les deux pourraient présenter une pureté chromatographique similaire tout en contenant des quantités totales de matière différentes.
C’est pourquoi pureté, dosage/teneur et identité sont des paramètres analytiques distincts.
Un bon dossier analytique ne devrait pas utiliser un seul chiffre pour répondre à toutes les questions relatives à la qualité.
Checklist pratique pour comparer deux COA
Lorsque vous comparez deux rapports HPLC, je recommande de procéder méthodiquement.
1. Le numéro de lot est-il identique ?
Vérifiez :
- le numéro de lot ;
- le numéro de batch ;
- l’identification de l’échantillon ;
- le nom du produit ;
- la date d’analyse.
Si les identifiants ne correspondent pas, vous n’êtes peut-être tout simplement pas en train de comparer le même matériau.
2. La méthode HPLC est-elle détaillée ?
Recherchez :
- la colonne ;
- les dimensions de la colonne ;
- la phase stationnaire ;
- la phase mobile ;
- le gradient ;
- le débit ;
- la température ;
- la longueur d’onde de détection ;
- le volume injecté ;
- la durée de l’analyse.
Plus la méthode est transparente, plus le résultat est facile à interpréter.
3. Le chromatogramme complet est-il disponible ?
Un chromatogramme complet est généralement beaucoup plus informatif qu’un grand chiffre de pureté imprimé dans un tableau.
Examinez :
- le pic principal ;
- le temps de rétention ;
- les pics secondaires ;
- les épaulements ;
- la ligne de base ;
- les pics précoces liés au système ou à des composants non retenus ;
- les pics tardifs ;
- les marqueurs d’intégration.
Un chromatogramme fortement recadré peut masquer certaines informations pertinentes.
4. Un tableau d’intégration est-il fourni ?
Dans l’idéal, vous devriez pouvoir examiner les principaux pics et leurs surfaces relatives.
Cela permet de répondre à une question fondamentale :
« D’où vient exactement le pourcentage de pureté indiqué ? »
5. La méthode de calcul est-elle expliquée ?
Vérifiez si le laboratoire précise notamment :
- la normalisation des surfaces ;
- les impuretés déclarables ;
- les impuretés spécifiées ;
- les impuretés non spécifiées ;
- les impuretés totales ;
- le pourcentage du pic principal.
Sans connaître la méthode de calcul, deux pourcentages peuvent ne pas être directement comparables.
6. L’identité du peptide est-elle vérifiée séparément ?
La HPLC fournit principalement des informations chromatographiques.
Une technique complémentaire comme la spectrométrie de masse (MS) peut apporter des informations importantes sur la masse moléculaire et l’identité du composé.
Ces analyses répondent à des questions différentes.
Un COA ne doit donc pas être interprété comme si un seul test permettait à lui seul de démontrer tous les aspects de la qualité d’un peptide.
7. La quantité ou la teneur est-elle indiquée séparément ?
Lorsque cela est pertinent, recherchez un dosage ou une mesure de teneur.
Posez-vous d’abord la question :
« Quelle quantité de matière est réellement présente ? »
Puis :
« Quelle est la pureté chromatographique de cette matière ? »
Ce sont deux questions différentes.
Deux études de cas illustratives sur l’analyse HPLC de peptides
Les exemples suivants montrent comment deux rapports peuvent légitimement présenter des résultats différents. Il s’agit de scénarios analytiques illustratifs et non de rapports de laboratoire originaux présentés comme preuves.
Étude de cas 1 : Tirzépatide
Imaginons qu’un même lot de production de tirzépatide lyophilisé soit envoyé à deux laboratoires indépendants.
Laboratoire A
- Pureté HPLC : 99,4 %
- Temps de rétention du pic principal : 12,42 minutes
- Un pic secondaire déclaré
Laboratoire B
- Pureté HPLC : 98,1 %
- Temps de rétention du pic principal : 11,85 minutes
- Plusieurs pics secondaires détectés
À première vue, le laboratoire A semble avoir obtenu le « meilleur » résultat.
Mais cette conclusion serait prématurée.
Supposons que les deux laboratoires utilisent des colonnes et des conditions de gradient différentes.
La méthode du laboratoire B peut offrir une meilleure séparation des composants qui élueront à proximité les uns des autres.
Si le laboratoire B parvient à résoudre plusieurs petits pics supplémentaires que le laboratoire A ne sépare pas clairement, son pourcentage de pureté HPLC inférieur peut en réalité refléter une meilleure résolution chromatographique, et non une qualité inférieure du matériau.
C’est exactement pourquoi il peut être trompeur de comparer uniquement le chiffre principal.
Étude de cas 2 : Sémaglutide
Prenons un autre exemple illustratif avec du sémaglutide.
Laboratoire A
- Pureté HPLC : 98,9 %
- Détection : 214 nm
Laboratoire B
- Pureté HPLC : 99,6 %
- Détection : autre longueur d’onde
La conclusion instinctive serait :
« Le laboratoire B a trouvé un échantillon plus pur. »
Mais il faut davantage d’informations.
Les colonnes étaient-elles identiques ?
Les gradients étaient-ils identiques ?
Les échantillons ont-ils été préparés de la même manière ?
Les laboratoires utilisaient-ils les mêmes règles d’intégration ?
Les échantillons ont-ils été analysés le même jour ?
L’humidité a-t-elle été mesurée ?
Les mêmes catégories d’impuretés ont-elles été prises en compte dans le calcul de la pureté ?
Sans ces réponses, comparer 98,9 % et 99,6 % comme s’il s’agissait de mesures parfaitement interchangeables serait scientifiquement fragile.
La bonne approche consiste à comparer d’abord les méthodes analytiques, puis les pourcentages.
Comment un chercheur expérimenté devrait lire un rapport HPLC
Une bonne manière de lire un COA HPLC consiste à progresser de la question la plus générale vers la plus précise.
Étape 1 : Quel matériau a été analysé ?
Vérifiez le produit, le lot, le batch et l’identification de l’échantillon.
Étape 2 : Qu’est-ce qui a exactement été mesuré ?
Déterminez si le chiffre correspond à une pureté HPLC par normalisation des surfaces, à un dosage, à une teneur ou à une autre mesure.
Étape 3 : Comment la mesure a-t-elle été effectuée ?
Examinez la méthode HPLC.
Étape 4 : Que montre réellement le chromatogramme ?
Regardez le tracé lui-même plutôt que de vous fier uniquement au tableau récapitulatif.
Étape 5 : Comment les pics ont-ils été intégrés ?
Examinez le tableau d’intégration et les critères de déclaration lorsqu’ils sont disponibles.
Étape 6 : Existe-t-il des analyses complémentaires ?
Tenez compte séparément de l’identification et des autres paramètres de qualité.
Cette approche transforme l’interprétation d’un COA : on passe de la simple comparaison de chiffres à une véritable évaluation analytique.
Les erreurs courantes lors de la comparaison de rapports HPLC
Erreur 1 : Choisir automatiquement le pourcentage le plus élevé
Un résultat à 99,8 % n’est pas automatiquement une preuve plus solide qu’un résultat à 98,9 %.
La méthode compte.
Erreur 2 : Supposer que toutes les méthodes C18 sont identiques
C18 désigne une large catégorie de phases stationnaires.
Différentes colonnes peuvent présenter une sélectivité et des performances différentes.
Erreur 3 : Confondre pureté HPLC et pureté massique
Un pourcentage de surface chromatographique n’est pas automatiquement équivalent à un pourcentage en masse.
Cette distinction est fondamentale.
Erreur 4 : Ignorer le chromatogramme
Un chiffre de pureté sans données chromatographiques permettant de le contextualiser fournit beaucoup moins d’informations.
Erreur 5 : Ignorer la date d’analyse
Si deux échantillons ont été analysés plusieurs mois à des conditions différentes, l’historique de l’échantillon devient pertinent.
Erreur 6 : Supposer que des résultats différents signifient qu’un laboratoire s’est trompé
Des méthodes analytiques différentes peuvent légitimement produire des résultats différents.
Il faut comparer les méthodes avant de conclure qu’une erreur a été commise.
Erreur 7 : Penser que davantage de décimales signifie davantage de précision
Un rapport indiquant :
99,47 %
n’est pas nécessairement plus scientifiquement significatif qu’un rapport indiquant :
99,5 %
La qualité de la méthode analytique et du système de mesure est plus importante que la précision affichée artificiellement.
Que devrait contenir un bon COA de peptide ?
Lorsque j’examine des COA de peptides, je recherche avant tout la traçabilité et la transparence analytique, et pas uniquement un pourcentage de pureté impressionnant.
Les informations utiles comprennent notamment :
Identification de l’échantillon
- Nom du produit
- Numéro de lot/batch
- Identifiant de l’échantillon
- Date d’analyse
Informations HPLC
- Type de colonne
- Dimensions de la colonne
- Phase mobile
- Gradient
- Débit
- Longueur d’onde de détection
- Conditions d’injection
- Durée de l’analyse
- Temps de rétention
Données chromatographiques
- Chromatogramme complet
- Pic principal
- Pics secondaires
- Informations d’intégration
- Surfaces des pics
- Pourcentages relatifs
Caractérisation complémentaire
Selon le cas :
- Spectrométrie de masse
- Dosage/teneur
- Humidité
- Solvants résiduels
- Autres analyses pertinentes
Aucun résultat analytique isolé ne devrait être interprété comme s’il répondait à lui seul à toutes les questions concernant la qualité d’un peptide.
Pourquoi les analyses par des laboratoires tiers peuvent-elles être utiles ?
Les analyses indépendantes peuvent fournir des éléments supplémentaires pour évaluer un échantillon de peptide.
Des laboratoires tels que Janoshik, MZ Biolabs, Vanguard Laboratory, ILS Laboratories, ainsi que d’autres prestataires analytiques, peuvent utiliser des méthodes et des formats de rapport différents.
Cela ne signifie pas qu’un laboratoire doit automatiquement être considéré comme meilleur simplement parce que son pourcentage de pureté est plus élevé.
Les questions essentielles restent les mêmes :
Quelle méthode a été utilisée ?
L’échantillon est-il correctement identifié ?
Le rapport est-il traçable ?
Le chromatogramme est-il disponible ?
Les paramètres analytiques sont-ils indiqués ?
Des analyses complémentaires sont-elles disponibles ?
Lorsqu’on examine un COA réalisé par un laboratoire tiers, il faut évaluer la qualité globale des preuves analytiques, et pas simplement la taille du chiffre de pureté.
Ce que des années d’examen de COA de peptides m’ont appris
Mon expérience dans la fourniture de peptides et l’éducation des chercheurs depuis 2003 m’a appris que l’un des principaux problèmes rencontrés lors de l’achat de peptides n’est pas nécessairement l’absence d’analyses de laboratoire.
C’est souvent la mauvaise interprétation des résultats analytiques.
Les chercheurs reçoivent fréquemment un COA et recherchent immédiatement une seule information :
Pureté : 99 %
Mais l’analyse approfondie d’un COA va beaucoup plus loin.
Je veux savoir :
- Quel échantillon a été analysé ?
- De quel lot provient-il ?
- Quel laboratoire l’a analysé ?
- Quelle méthode analytique a été utilisée ?
- Quelle colonne a été utilisée ?
- Quelle longueur d’onde a été utilisée ?
- Que montre réellement le chromatogramme ?
- Comment les pics ont-ils été intégrés ?
- Quels autres tests ont été réalisés ?
- La quantité rapportée est-elle cohérente avec la spécification du produit ?
- Le rapport peut-il être vérifié de manière indépendante ?
Après de nombreuses années de travail avec des chercheurs, une chose est devenue évidente : il est beaucoup plus important d’apprendre à quelqu’un comment interpréter les données que de simplement lui dire quel chiffre il doit croire.
C’est également pourquoi la transparence documentaire est importante pour les fournisseurs de peptides.
Chez OasBioScience, notre objectif est d’aider les chercheurs à comprendre la signification des documents analytiques, plutôt que de leur demander de faire aveuglément confiance à un pourcentage.
Pour plus d’informations sur nos peptides destinés à la recherche et sur la documentation analytique disponible, consultez oasbioscience.com.
La règle la plus importante pour comparer les pourcentages de pureté HPLC
Si vous ne devez retenir qu’une seule chose de cet article, retenez celle-ci :
Ne comparez jamais deux pourcentages de pureté HPLC sans commencer par comparer les méthodes qui ont permis de les obtenir.
Une différence entre :
98,2 % et 99,4 %
ne signifie pas automatiquement qu’il existe exactement 1,2 point de différence dans la qualité réelle du matériau.
Les chiffres peuvent avoir été obtenus avec des :
- colonnes différentes ;
- gradients différents ;
- phases mobiles différentes ;
- longueurs d’onde différentes ;
- températures différentes ;
- préparations d’échantillon différentes ;
- paramètres d’intégration différents ;
- seuils de déclaration différents.
Le matériau lui-même peut également avoir changé entre les deux analyses.
La bonne méthode de comparaison est donc :
Méthode → chromatogramme → intégration → identification de l’échantillon → analyses complémentaires → pourcentage rapporté
et non :
99,4 % > 98,2 % = meilleur
Cette dernière approche est beaucoup trop simpliste.
Pour aller plus loin
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Références scientifiques
Pour obtenir davantage d’informations scientifiques évaluées par des pairs sur la stabilité des peptides, la préparation stérile et les pratiques pharmaceutiques de reconstitution, consultez les ressources suivantes :
Agence européenne des médicaments (EMA)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Foire aux questions
1. Pourquoi deux rapports HPLC indiquent-ils des pourcentages de pureté différents ?
Deux rapports HPLC peuvent présenter des pourcentages différents parce que les laboratoires peuvent utiliser des colonnes, phases mobiles, gradients, températures, longueurs d’onde, préparations d’échantillons, paramètres d’intégration ou critères de déclaration différents.
Les échantillons peuvent également avoir évolué entre les deux analyses.
Une différence ne signifie donc pas automatiquement qu’un laboratoire s’est trompé.
2. Quel pourcentage de pureté HPLC faut-il croire ?
Il ne faut pas choisir un rapport uniquement parce qu’il affiche le pourcentage le plus élevé.
Il faut plutôt examiner la méthode analytique, le chromatogramme, les informations d’intégration, l’identification de l’échantillon, la date d’analyse, la traçabilité du laboratoire et les analyses complémentaires disponibles.
Un résultat légèrement inférieur mais accompagné d’une méthodologie transparente peut fournir davantage d’informations qu’un pourcentage supérieur sans données justificatives.
3. Une pureté HPLC de 99 % signifie-t-elle que le peptide représente 99 % de la masse du produit ?
Pas nécessairement.
La pureté HPLC et la teneur en peptide sont deux mesures différentes.
Le pourcentage de surface chromatographique décrit généralement la composition relative observée dans le cadre de la méthode analytique utilisée. Il ne permet pas, à lui seul, d’établir la quantité absolue de peptide cible présente dans un flacon.
Un dosage/une teneur, ainsi que des mesures telles que l’humidité et d’autres paramètres pertinents, peuvent être nécessaires pour caractériser plus complètement le matériau.
4. Un même peptide peut-il avoir des pourcentages de pureté HPLC différents selon les laboratoires ?
Oui.
Si les laboratoires utilisent des méthodes analytiques différentes, leurs résultats peuvent différer.
La sélectivité de la colonne, les conditions de gradient, la longueur d’onde de détection, la préparation de l’échantillon et l’intégration des pics peuvent toutes contribuer à ces différences.
C’est pourquoi deux COA doivent être comparés sur le plan méthodologique et pas uniquement sur leur pourcentage de pureté.
5. Un pourcentage de pureté HPLC plus élevé signifie-t-il toujours que le peptide est meilleur ?
Non.
Un pourcentage de pureté HPLC plus élevé ne constitue pas automatiquement la preuve d’une meilleure qualité globale du produit.
Il faut examiner séparément l’identité, la pureté chromatographique, la teneur/le dosage et les autres caractéristiques de qualité pertinentes.
6. La colonne HPLC influence-t-elle les résultats de pureté des peptides ?
Oui.
Des colonnes différentes peuvent présenter des caractéristiques de sélectivité et de séparation différentes, même lorsqu’elles appartiennent à la même catégorie générale.
Cela peut modifier la séparation des impuretés peptidiques proches et, par conséquent, influencer le pourcentage de pureté HPLC rapporté.
7. L’intégration des pics peut-elle modifier un pourcentage de pureté HPLC ?
Oui.
L’intégration détermine la manière dont le signal chromatographique est attribué aux différents composants.
Le positionnement de la ligne de base, les seuils de détection, les fenêtres d’intégration et le traitement des pics qui se chevauchent peuvent influencer les surfaces relatives calculées.
La procédure d’intégration doit donc être adaptée à la méthode analytique, documentée et appliquée de manière cohérente.
8. 214 nm est-elle toujours la bonne longueur d’onde pour analyser les peptides par HPLC ?
Pas nécessairement.
Une détection autour de 214 nm est largement utilisée pour l’analyse des peptides en raison de l’absorbance importante des liaisons peptidiques dans cette région. Toutefois, la longueur d’onde appropriée dépend de la méthode analytique et des substances étudiées.
La question scientifiquement pertinente est de savoir si la longueur d’onde choisie est adaptée et justifiée pour la méthode utilisée.
9. Faut-il comparer uniquement le chiffre de pureté indiqué sur un COA ?
Non.
Il est préférable d’examiner l’ensemble du dossier analytique lorsqu’il est disponible.
Les informations importantes comprennent le numéro de lot, la date d’analyse, le laboratoire, la méthode HPLC, le chromatogramme, les données d’intégration, l’analyse d’identité et les informations pertinentes concernant le dosage ou la teneur.
Le pourcentage de pureté n’est qu’un élément parmi d’autres.
10. Que faut-il vérifier en premier lorsque deux COA de peptides ne donnent pas le même résultat ?
Commencez par vérifier le numéro de lot et la méthodologie analytique.
Comparez ensuite :
- La colonne
- La phase mobile
- Le gradient
- La longueur d’onde de détection
- Le débit
- La température
- La durée de l’analyse
- La préparation de l’échantillon
- Les critères d’intégration
- Le chromatogramme et le tableau des pics
Ce n’est qu’après avoir comparé ces éléments qu’il devient pertinent d’interpréter la différence entre les pourcentages de pureté.
À retenir
Le pourcentage de pureté HPLC est une donnée précieuse, mais il ne doit jamais être considéré comme une mesure complète de la qualité globale d’un peptide.
Deux laboratoires peuvent analyser un matériau provenant du même lot et obtenir des pourcentages différents parce que la chimie analytique dépend à la fois de l’échantillon et de la méthode utilisée pour le mesurer.
La chimie de la colonne compte.
La phase mobile compte.
Les conditions du gradient comptent.
La longueur d’onde compte.
La préparation de l’échantillon compte.
L’intégration des pics compte.
Les critères de déclaration comptent.
Et, surtout, l’échantillon lui-même peut évoluer.
L’une des plus grandes erreurs qu’un chercheur puisse commettre est de regarder deux COA et de considérer automatiquement que le chiffre le plus élevé est le meilleur.
Posez plutôt cette question :
« Quel processus analytique a produit ce chiffre ? »
C’est cette question qui permet d’obtenir une évaluation beaucoup plus pertinente.
Après des années d’expérience dans la fourniture de peptides, l’éducation des chercheurs et l’examen de COA provenant de laboratoires tiers, c’est l’une des leçons les plus importantes que je puisse transmettre :
N’achetez pas un chiffre. Comprenez la mesure.
Pour les chercheurs qui évaluent la documentation analytique d’un peptide, un COA transparent comprenant une identification traçable de l’échantillon, une méthodologie appropriée, des données chromatographiques et, lorsque cela est pertinent, des analyses complémentaires fournit beaucoup plus d’informations qu’un pourcentage de pureté élevé présenté sans éléments justificatifs.
Le pourcentage de pureté HPLC est une mesure analytique — ce n’est pas une définition complète de la qualité d’un produit.
Mention concernant l’usage recherche : Les résultats analytiques doivent être interprétés conformément à la méthode utilisée par le laboratoire et à l’application de recherche prévue. Les produits destinés à la recherche ne sont pas destinés au diagnostic, au traitement, à la guérison ou à la prévention d’une maladie chez l’être humain ou l’animal.
